Pada praktikum bagian 8 ini dilakukan 3 kegiatan, antara lain pengenalan alat-alat dan teknik sterilisasi, pembuatan media, serta teknik isolasi.
1. Pengenalan alat-alat dan teknik sterilisasi
Kegiatan yang pertama adalah pengenalan alat-alat, teknik sterilisasi. Pengenalan alat yang berkaitan dengan mikroba sangat penting karena dengan pengenalan alat, mahasiswa dapat membedakan alat-alat yang diperlukan dalam sterilisasi, isolasi, dan identifikasi mikroba. Pada pengenalan alat dikenalkan beberapa alat seperti: autoclave, petridish, tabung reaksi, Erlenmeyer, ose, drigalsky, lampu Bunsen, dan laminar flow. Setelah dikenalkan alat-alat yang diperlukan dalam praktikum ini juda dijelaskan bagian-bagian autoclave serta cara penggunaan autoclave secara umum. Pada kegiatan pertama ini dijelaskan teknik sterilisasi mulai dari cara mensterilakan alat seperti pada tabung reaksi, petridish, dan Erlenmeyer. Pada tabung reaksi dan Erlenmeyer lubang bagian atas ditutup dengan kapas secara kuat agar tidak ada udara yang masuk, kemudian ditutup dengan kertas payung dan selanjutnya diikat dengan karet hingga kencang/kuat. Pada petridish, dua pasang petridish dibungkus dengan kertas payung kemudian diikat dengan karet dan dipastikan tidak ada udara yang dapat masuk. Alat-alat yang sudah dibungkus kemudian disterilkan pada sebuah alat yang disebut autoclave (automatic steam sterilization) hingga suhu 121 ̊C.
Sebelum melakukan kegiatan yang berkaitan dengan mikrobiologi, praktikan, alat-alat praktikum dan lingkungan sekitar (meja praktikum) harus dalam keadaan steril sehingga dapat mengurangi terjadinya kontaminasi. Dengan melakukan sterilisasi diharapkan kuman-kuman dan mikroorganisme kompetitor akan mati. Sterilisasi tersebut menggunakan larutan alkohol. Adapun cara pemakaian alkohol adalah dengan menyemprotkan pada tangan dan lingkungan sekitar seperti meja dan tempat yang akan digunakan untuk praktikum kemudian mengusapnya hingga kering dan untuksterilisasi alat dengan cara mencelupkannya pada larutan alkohol, biasanya pada alat yang digunakan untuk mengambil bakteri atau jamur. Pada penyemprotan alkohol harus dilakukan di tempat yang jauh dari api agar tidak terjadi kebakaran. Pada saat menggunakan alat dan melakukan kegiatan sebaiknya didekatkan pada nyala api.
Sterilisasi dengan autoclave merupakan teknik sterilisasi yang paling baik, hal ini karena uap air panas dengan tekanan tinggi memperbesar penetrasi uap air dalam sel-sel mikrobia yang menyebabkan koagulasi protein-protein protoplasma. Koagulasi protein-protein protoplasma ini yang mempercepat proses kematian mikroba. Hal ini juga sesuai dengan tujuan dari sterilisasi yaitu usaha untuk membebaskan alat-alat dan bahan-bahan dari segala macam bentuk kehidupan mikroorganisme. Selain dengan autoclave, sterilisasi juga dapat dilakukan dengan menggunakan alkohol, memanaskannya pada oven atau di atas api secara langsung.
2. Pembuatan Media
Pada kegiatan kedua yaitu pembuatan media, digunakan media PDA dan NA. media ini termasuk media padat, yaitu media yang berbentuk padat dan dibuat dengan menambahkan bahan pemadat berupa agar, gelatin atau silica gel. Pada praktikum ini digunakan agar karena agar merupakan bahan pemadat yang tidak terhidrolisis oleh mikroorganisme, tidak menghambat pertumbuhan mikroorganisme dan tidak mencair pada temperatur ruang. Untuk gelatin tidak digunakan karena gelatin dihidrolisis oleh mikroorganisme dan mencair pada temperatur ruang, sehingga bahan pemadat agar lebih dipilih dalam praktikum ini.
Pembuatan media PDA digunakan bahan-bahan, antara lain:
Kentang : 100 gr
Dektrosa : 10 gr
Agar : 2%
Akuades : 500 ml
Cara membuat media untuk pertumbuhan mikrobia (bakteri dan jamur) adalah: mengupas kentang dan mencuci bersih, kemudian memotong-motong menjadi kotak-kotak kecil (2x2 cm), kemudian merebus potongan kentang tersebut dalam 500 ml akuades selama 1,5-2 jam, setelah itu menyaring campuran dengan kain tipis berlapis kapas sehingga diperoleh cairan ekstrak kentang yang bening, selanjutnya menambahkan dektrosa dan agar, kemudian memanaskan dan mengaduk hingga homogen, lalu menambahkan akuades hingga diperoleh volume akhir 1000 ml, dan yang terakhir adalah sterilisasi dengan autoclave (121oC selama 15 menit).
Setelah PDA disterilisasi, dituangkan ke dalam petridish kemudian setelah media memadat disimpan dalam keadaan terbalik. Penyimpanan terbalik bertujuan agar uap air yang terbentuk tidak menjadi kontaminan atau menjadi penghambat pertumbuhan mikroorganisme yang dibiakkan dalam petridish.
3. Teknik Isolasi
Pada kegiatan ketiga adalah teknik isolasi yang bertujuan untuk mengenalkan cara-cara isolasi mikrobia dan mengamati perbedaan morfologi jamur dan bakteri. Jamur dan bakteri yang diisolasi adalah hasil penangkapan sehari sebelum praktikum oleh laboran. Isolasi mikrobia adalah memisahkan mikrobia tertentu dari lingkungannya yaitu pada saat penangkapan dan menumbuhkannya sebagai biakan murni pada medium buatan.
Pada kegiatan ini dikenalkan tiga cara yang digunakan dalam teknik isolasi, yaitu streak plate, spread plate dan pour plate. Namun pada praktikum kali ini hanya streak plate yang digunakan. Metode ini dilakukan dengan cara menggoreskan satu ose kultur campuran pada medium agar. Kemudian diinkubasikan secara terbalik pada suhu kamar selama 24 - 48 jam. Selain itu, dipraktekkan juga radian streak dan continuous streak.
Langkah pertama yang harus dilakukan dalam melakukan teknik isolasi adalah mengambil mikroba tertentu di suatu kultur campuran. Dalam melakukan hal ini dapat menggunakan ose yang sebelumnya dipijarkan pada pemanas Bunsen. Selanjutnya setelah hangat kuku dapat digunakan untuk mengambil satu koloni dari kultur campuran. Cara menyentuhkan pada bagian koloni yang akan dibiakkan dalam melakukannya diusahakan tidak menyentuh koloni yang lain. Dalam pengambilan ini diusahakan didekatkan dengan api namun tidak sampai menyentuh agar menghindari kontaminasi mikroba lain. Selanjutnya sampel tersebut dipindahkan ke media biakan.
Pada praktikum kali ini juga dilakukan penangkapan mikrobia oleh praktikan. Penangkapan ini dilakukan pada hari Kamis, tanggal 6 Mei 2010. Sebelum melakukan teknik isolasi, terlebih dahulu dilakukan penumbuhan mikrobia yang akan digunakan sebagai bahan biakan dalam teknik isolasi. Dalam menumbuhkan mikrobia ini diperlukan media pembiakan yang kaya akan nutrien. Media yang digunakan dalam percobaan ini adalah PDA dan NA. Media PDA dibuat sendiri oleh praktikan, sedangkan NA sudah disediakan oleh laboran. Media PDA digunakan untuk menumbuhkan jamur atau kapang, sedangkan media NA digunakan untuk menumbuhkan bakteri. Penangkapan mikrobia dilakukan pada dua tempat, yaitu di luar ruangan dan di dalam ruangan. Penangkapan mikrobia dilakukan dengan cara membuka petridish yang berisi media selama 15 menit. Penangkapan mikrobia di dalam ruangan diletakkan di dekat washtafel dengan kondisi lingkungan:
- Intensitas cahaya : 0,01 candela
- Kelembaban udara : 68%
- Suhu udara : 30 ̊C
Hasil penangkapan pada kondisi ini adalah seperti pada gambar di bawah ini:
PDA NA
Pada PDA yang diamati pada hari Jum’at belum jelas terlihat mikrobia yang tumbuh. Pada hari Senin, dilakukan pengamatan lagi, dan terlihat jelas pertumbuhan mikroba yang lebih padat daripada pengamatan sebelumnya. Ciri-ciri yang terlihat pada pengamatan ini adalah sebagai berikut:
PDA NA
Gambar di atas merupakan hasil dari pertumbuhan mikroba di dalam ruangan yang diamati pada hari senin. Di dalam media PDA tumbuh jamur, dengan ciri-ciri terdapat benang-benang hifa berwarna putih kekuningan. Sedangkan pada media NA tumbuh mikroba dengan cirri-ciri seperti koloni bakteri, yaitu bintik-bintik kuning dan putih serta terdapat bintik-bintik yang membentuk garis, dan tidak memiliki hifa seperti pada jamur.
Pada pengamatan ini belum dapat diketahui jenis jamur dan bakteri yang tumbuh dalam media karena tidak dilakukan pengamatan lebih jauh menggunakan mikroskop. Pengamatan hanya dilakukan dengan mata telanjang.
Penangkapan mikrobia yang dilakukan di luar ruangan yang diletakkan di dekat tempat sampah dengan kondisi lingkungan sebagai berikut:
- Intensitas cahaya : 2,36 candela
- Kelembaban udara : 67%
- Suhu udara : 29 ̊C
Hasil dari pengamatan mikrobia pada hari Jumat ditunjukkan pada gambar di bawah ini:
PDA NA
Pada gambar di atas ditunjukkan bahwa mikrobia belum nampak jelas tumbuh di dalam media, sehingga identifikasi lebih lanjut belum dapat dilakukan. Akan tetapi pada media NA sudah tampak bintik-bintik berwarna putih dan menunjukkan cirri-ciri bakteri, yaitu tidak terdapat hifa seperti halnya pada jamur.
Pengamatan pada hari Senin didapatkan hasil sebagaimana tampak pada gambar di bawah ini:
PDA NA
Berdasarkan gambar di atas, mikrobia sudah banyak tumbuh pada media. Pada media PDA terlihat mikroba jamur dengan ciri-ciri terdapat benang-benang hifa dan sebagian berwarna hitam. Warna hitam ini merupakan spora dari jamur. Jamur yang tumbuh pada media ini termasuk dalam golongan jamur kapang. Berdasarkan literatur, jamur ini merupakan mikroba dengan struktur talus berupa benang-benang (hifa) yang terjalin seperti jala (myselium). Hifa dapat berekat (septat) dengan inti tunggal/ lebih dan hifa tidak bersekat (aseptat). Penampakan morfologi koloni pada umumnya seperti benang (filamentous) yang pertumbuhannya membentuk lingkaran. Morfologi koloninya dapat dengan mudah dibedakan dengan bakteri walaupun ada beberapa jenis bakteri yang koloninya mirip jamur.
Pada media NA tumbuh mikroba berupa bakteri dengan ciri-ciri bintik-bintik kuning dan tidak berhifa. Pada pengamatan ini praktikan juga belum dapat menentukan jenis bakteri yang tumbuh pada media tersebut karena tidak digunakan mikroskop untuk pengamatan lebih teliti.
Dengan membandingkan pertumbuhan mikroba yang ditangkap di luar dan di dalam ruangan, maka dapat dikatakan bahwa di lingkungan luar jamur maupun bakteri lebih banyak daripada di dalam ruangan. Hal ini karena kondisi lingkungan mendukung pertumbuhan mikroba seperti penangkapan media yang dilakukan di dekat tempat sampah maupun kondisi lingkungan seperti kelembaban maupun suhu udara.
Pada praktikum ini jamur tumbuh pada media PDA, sedangkan bakteri pada media NA. Hal ini karena nutrien yang dibutuhkan jamur terdapat pada media PDA, sedangkan nutrien yang dibutuhkan bakteri terdapat pada media NA.
A. KESIMPULAN
Berdasarkan tiga kegiatan yang telah dilakukan ini, maka dapat disimpulkan bahwa :
1. Pengenalan alat dan teknik sterilisasi
Alat-alat yang digunakan dalam laboratorium mikrobiologi dan teknik sterilisasi antara lain:
a. Autoclave (Automatic Steam Sterilisation) f. Driglasky
b. Petridish g. Lampu bunsen
c. Tabung reaksi h. Laminar flow
d. Erlenmeyer
e. Ose
2. Pembuatan media
Cara membuat media untuk pertumbuhan mikrobia (bakteri dan jamur) dengan menggunakan PDA (Potato Dektrosa Agar) yaitu dengan langkah-langkah sebagai berikut:
a. Mengupas kentang dan mencuci bersih, kemudian memotong-motong menjadi kotak-kotak kecil (2x2 cm).
b. Merebus potongan kentang tersebut dalam 500 ml akuades selama 1,5-2 jam.
c. Menyaring campuran dengan kain tipis berlapis kapas sehingga diperoleh cairan ekstrak kentang yang bening.
d. Menambahkan dektrosa dan agar, kemudian memanaskan dan mengaduk hingga homogen.
e. Menambahkan akuades hingga diperoleh volume akhir 1000 ml.
f. Sterilisasi dengan autoclave (121oC selama 15 menit).
3. Teknik isolasi
a. Cara isolasi mikrobia
1) Mengambil media dalam petridish yang telah dibuat.
2) Meletakkan petridish di atas meja dan buka sebentar, kurang lebih 1 menit kemudian menutup kambali.
3) Menginkubasikan secara terbalik pada temperature optimium selama 24-48 jam.
4) Menyimpan dalam almari pendingin, melakukan pengamatan pertumbuhan bekteri dan jamur pada praktikum selanjutnya.
5) Mengamati bakteri dan jamur yang tumbuh secara makroskopis.
6) Setelah itu, masing-masing kelompok juga melakukan isolasi bakteri dengan teknik streak plate.
b. Perbedaan morfologi bakteri dan jamur
1. Jamur :
- Bintik-bintik berwarna hitam, abu-abu banyak, dan terdapat serabut (PDA penanaman)
- Terdapat pula koloni yang berwarna putih seperti kapas (NA penanaman)
§ Berwarna putih dominan dan ada yang berwarna abu-abu agak hitam (PDA penangkapan)
§ Tersusun dari hifa (benang-benang)
2. Bakteri
· Bintik-bintik kuning dan putih serta terdapat bintik-bintik yang membentuk garis
· Tidak memiliki hifa seperti pada jamur
B. DAFTAR PUSTAKA
Dwijoseputro. 1990. Dasar-dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan.
Koes Irianto. 2007. Mikrobiologi. Bandung: CV Yrama Widya.
Linus Suriawiria. 1986. Pengantar Makrobiologi Umum. Bandung: Angkasa.
Hadioetomo. 1994. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: Gramedia.
Jeneng Tarigan. 1988. Pengantar Makrobiologi. Jakarta: Depdikbud.
Stainer, Roger Y. 1982. Dunia Mikroba I. Jakarta: Bharata Karya Aksara.
